Page 2

vuzlit.ru

Подсчет тромбоцитов в крови

Для проведения данных исследований необходимо следующее оснащение рабочего места:

  1. Предметные стекла простые и шлифованные.
  2. Смесители для эритроцитов.
  3. Камеры Горяева.
  4. Микроскопы.
  5. Микроскоп с фазовоконтрастным устройством.
  6. Черная бумага.
  7. Ножницы.
  8. Осветитель для микроскопа.
  9. Сернокислый магний (MgS04).
  10. Кокаин.
  11. Хлористый натрий.
  12. Лимоннокислый натрий.
  13. Дистиллированная вода.
  14. Метиловый спирт или смесь Никифорова (смесь равных частей 96° этилового спирта и эфира).
  15. Основной раствор краски Романовского.
  16. Иммерсионное масло.
  17. Набор инструментов для укола в палец.

Тромбоциты - это небольшие образования величиной 2-3 мю. В них различают периферическую часть, напоминающую цитоплазму (гиаломер), и центральную зернистую часть, похожую на ядро (грануломер). Морфологические особенности гиаломера и грануломера зависят от возраста и состояния организма.

Для подсчета тромбоцитов требуются следующие реактивы:

  1. 14% раствор сернокислого магния (MgS04): 14 г MgS04 помещают в колбу на 100 мл и доливают дистиллированной водой до метки 100 мл. Раствор магнезии может быть заменен 5% раствором лимоннокислого натрия [(приготовление см. статью «Реакция оседания эритроцитов (РОЭ) по Панченкову»]. Эти реактивы препятствуют склеиванию тромбоцитов.
  2. Реактив для подсчета тромбоцитов в счетной камере Горяева: 3 г кокаина и 0,4 г хлористого натрия растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

Взятие крови для подсчета тромбоцитов в мазке

Подсчет в крови тромбоцитов производят по указанию врача. На очищенный спиртом и эфиром палец больного помещают каплю стерильного 14% раствора сернокислого магния или 5% раствора лимоннокислого натрия и через каплю реактива делают укол в палец. Выступившую каплю крови смешивают с помощью парафинированной стеклянной палочки или пастеровской пипетки с реактивом, готовят мазки крови и окрашивают их в течение 40-60 минут краской Романовского, разведенной на нейтральной дистиллированной воде так же, как для мазков крови.

Тромбоциты окрашиваются в розовато-фиолетовый цвет. Параллельно в смеситель берут кровь для подсчета эритроцитов (см. тему «Взятие крови и подсчет эритроцитов и лейкоцитов в счетной камере»).

Подсчет тромбоцитов производят с ограничителем поля зрения (по Фонио). Для этого из кусочка бумаги вырезают кружок, по размеру равный 15-копеечной монете, складывают пополам и вчетверо, вершину конуса срезают, в результате чего в центре круга образуется «окошко» (рис. 35). Ограничитель поля зрения вставляют в окуляр (на металлический мостик), предварительно сняв верхнюю линзу окуляра. Вновь навинтив верхнюю линзу, вставляют окуляр в тубус микроскопа. С ограничителем поля зрения насчитывают в среднем 50 эритроцитов в каждом поле зрения микроскопа. Пользуясь иммерсионной системой, одновременно в мазке подсчитывают эритроциты и тромбоциты. Подсчет тромбоцитов заканчивают, насчитав 1000 эритроцитов. По ходу подсчета результаты записывают на бумаге. Затем в камере Горяева подсчитывают количество эритроцитов в 1 мм3 крови. Зная количество эритроцитов в 1 мм3 и количество тромбоцитов на 1000 эритроцитов, производят расчет.

Пример расчета. На 1000 эритроцитов подсчитано 70 тромбоцитов. Количество эритроцитов в 1 мм3 крови (подсчитаны в камере Горяева) составляет 4 200 000. Количество тромбоцитов в 1 мм3 равно: 70x4200000/1000 = 294 000.

Практически количество подсчитанных тромбоцитов умножают на первые четыре цифры числа эритроцитов, подсчитанных в камере Горяева. Норма тромбоцитов при подсчете по этому методу 200 000-400 000 в 1 мм3.

Подсчет тромбоцитов в счетной камере

Подсчет тромбоцитов в счетной камере производят следующим образом. Кровь набирают в смеситель для эритроцитов до метки 0,5, а раствор кокаина - до метки 101 и оставляют на 30 минут. Меланжер встряхивают, выпускают первые две капли, а третью каплю вносят в камеру Горяева, которую помещают на 5 минут во влажную камеру. Подсчет тромбоцитов производят так же, как и подсчет эритроцитов. Поэтому к подсчитанному количеству тромбоцитов приписывают четыре нуля. Подсчет можно производить как при обычном освещении микроскопа, так и с помощью фазовоконтрастного устройства. В камере Горяева тромбоциты имеют вид блестящих округлых образований, в несколько раз меньших, чем эритроциты. Этот метод отличается точностью и быстротой.

Норма тромбоцитов при подсчете по этому методу 150000-250000 в 1 мм3 крови.

ginekolog.my1.ru

Резистентность (ломкость) капилляров Проба Румпель-Лееде-Кончаловского

Из методов оценки ломкости капилляров чаще всего используется манжеточная проба Румпель-Лееде-Кончаловского (рис. 712051024).

Манжету для измерения АД накладывают на плечо, создавая в ней постоянное давление, равное 100 мм рт. ст. Через 5 минут оценивают результаты пробы. При отсутствии нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза ниже манжеты появляется лишь небольшое количество петехиальных (мелкоточечных) кровоизлияний (менее 10 петехий в зоне, ограниченной окружностью диаметром 5 см). При повышении проницаемости сосудов или тромбоцитопении число петехий в этой зоне превышает 10 (положительная проба).

Метод Дьюка

Предварительно мочку уха согревают между пальцами.

Стерильным скарификатором или плоским ланцетом прокалывают нижний валик мочки уха (глубина прокола 3,5—4,0 мм) и включают секундомер.

Выступающие капли крови каждые 30 с промокают фильтровальной бумагой, не прикасаясь к ранке. Как только наступит момент, когда новые капли крови не образуются, выключают секундомер и определяют общую длительность кровотечения, а также оценивают размеры капель (рис. 712051042).

Рис. 712051042. Определение времени кровотечения по Дьюку (а) у здорового человека (время кровотечения 3,5 мин.) и (б) у больного с выраженной тромбоцитопенией (время кровотечения 20 мин.)

Запомните

В норме время кровотечения по Дьюку не превышает 4 мин. Его увеличение наблюдается при выраженных тромбоцитопениях или/и тяжелых нарушениях их функции (тромбоцитопатиях).

Следует помнить также, что у 60 % больных с этой патологией тест оказывается отрицательным, и время кровотечения нормально.

Метод Айви

Несколько более чувствительным является тест Айви, когда оценивают время кровотечения из надрезов на коже ладонной поверхности верхней трети предплечья на фоне искусственного повышения венозного давления с помощью манжеты для определения АД, в которой поддерживают давление 40 мм рт. ст. (рис. 1.87).

В норме время кровотечения по Айви не превышает 8 минут.

Подсчет числа тромбоцитов

Наибольшее распространение в настоящее время получили три метода подсчета тромбоцитов в крови:

  1. Подсчет в камере Горяева;

  2. Подсчет в мазках крови;

  3. Электронно-автоматический метод.

Подсчет в камере Горяева

Метод подсчета тромбоцитов в камере Горяева является самым точным, но достаточно трудоемким.

Подсчет тромбоцитов в 1 л проводится по стандартной методике с учетом разведения крови и объема большого квадрата счетной сетки Горяева с применением фазово-контрастного микроскопа для лучшего контрастирования тромбоцитов.

Заполняют камеру Горяева и подсчитывают тромбоциты в 25 больших квадратах. Практически для расчета количества тромбоцитов в 1 л крови число сосчитанных в 25 больших квадратах кровяных пластинах умножают на 2х106.

Метод подсчета тромбоцитов в окрашенных мазках крови

Метод подсчета тромбоцитов в окрашенных мазках кровиоснован на подсчете числа тромбоцитов на 1000 эритроцитов с последующим пересчетом на 1 л крови.

Зная число эритроцитов в 1 л крови, рассчитывают количество тромбоцитов в этом объеме.

studfiles.net

Подсчет тромбоцитов в камере горяева


Подсчет количества тромбоцитов в крови: обзор методик от врача

Клинический анализ крови с подсчетом тромбоцитов проводится в следующих случаях:

  • диспансеризация человека с проведением общего анализа крови для профилактики появления различных заболеваний;
  • симптомы повышенного количества тромбоцитов, вследствие которых может произойти закупорка сосуда (повышенное давление, онемение конечностей);
  • клинические проявления сниженного количества кровяных пластинок (постоянное появление синяков и гематом, бледность кожных покровов);
  • проведение повторного анализа, если первый тест показал нарушение.

Во всех перечисленных случаях необходимо обратиться к врачу для проведения общего осмотра. Он назначит методику, которая будет наиболее приемлемой для пациента, чтобы правильно поставить диагноз.

Методы подсчета тромбоцитов в крови

Выделяют три методики для подсчета кровяных пластинок в капиллярной крови:

  • использование камеры Горяева;
  • методика по Фонио;
  • использование полуавтоматического анализатора.

Все методики применяются в клинических учреждениях. Каждая из них имеет положительные и отрицательные стороны. Возможен подсчет тромбоцитов ручным методом для просмотра их формы и размера. Если врач будет сомневаться в точности результата, он может назначить подсчет клеток с помощью полуавтоматического анализатора.

Унифицированные методы подсчета тромбоцитов

Унифицированными является методики, которые считаются более точными. Для подсчета кровяных пластинок таким тестированием является методика по Фонио и применение камеры Горяева.

С помощью анализов можно не только почитать точное число клеток, но и изучить их строение. Возможно определение раковых атипичных клеток.

Ручной подсчет тромбоцитов в крови

К анализам с ручным подсчетом тромбоцитов относятся использование камеры Горяева и метода по Фонио. Для обоих исследований осуществляется подсчет тромбоцитов в мазке под микроскопом. Полученные цифры подставляют в формулу, с помощью которой результат из 1 мкл переводится на 1 л крови.

Подсчет тромбоцитов в камере Горяева

Для подсчета тромбоцитов по методике Горяева необходимо приготовить раствор, состоящий из следующих веществ:

  • реактив 1 (кокаина гидрохлорид 3 г, натрия хлорид 0,25 г, фурацилин 0,25 г, дистиллированная вода 100 мл);
  • Реактив 2 (раствор оксалата аммония 1%).

Чаще всего применяют раствор оксалата аммония. Он эффективно уничтожает эритроциты, возможен свободный подсчет кровяных пластинок.

Рекомендуется для исследования выбирать венозную кровь. При использовании капиллярной биологической жидкости повышается риск образования сгустка. Если произойдет агрегация тромбоцитов, корректный подсчет количества тромбоцитов будет невозможен. К крови добавляют раствор ЭДТА, который препятствует образованию сгустка.

В пробирку наливают 0,02 мл крови, добавляют 4 мл реагента 1 или 2. Получившуюся массу перемешивают. В течение 30 минут должен произойти полный гемолиз красных кровяных телец. Пипеткой отбирают полученную жидкость, добавляют в камеру Горяева.

Внимание! Для осаждения кровяных пластинок камеру Горяева с жидкостью помещают во влажную среду. Кладут счетную камеру под микроскоп и подсчитывают форменные элементы.

Тромбоциты считают в 25 больших квадратах. Для этого микроскоп перемещают слева направо, вниз, справа налево. Кровяные пластинки под микроскопом выглядят, как небольшие фиолетовые точки.

Полученное значение подставляют в формулу подсчета тромбоцитов в мазке:

X=a×250×200/25

  • X – число тромбоцитов на 1 мкл биологической жидкости;
  • a -  количество тромбоцитов в 25 квадратах;
  • 200 – разведение крови;
  • 25- количество квадратов;
  • 1/250 – объем одного квадрата.

После завершения методики все используемые приспособления дезинфицируют с помощью этилового спирта.

Подсчет тромбоцитов в мазке крови (по Фонио)

Для методики используют капиллярную кровь, взятую из пальца. Ее помещают в капилляр, добавляют один из следующих реактивов, препятствующих образованию сгустка:

  • раствор ЭДТА 2, 6%;
  • раствор сульфата магния 14%.

Жидкость необходимо тщательно перемешать. Каплю разведенной крови добавляют на предметное стекло, размазывает пластиковым шпателем. Полученный мазок фиксирует с помощью метода по Романовскому-Гимзе.

Важно! Время фиксации зависит от применяемого реактива. Для ЭДТА оно составляет 40 минут, для сульфата магния — до 3 часов.

Мазок рассматривают под микроскопом, считают эритроциты и тромбоциты до получения значения, равного 1 тыс. Необходимо перемещать микроскоп слева направо, вниз, справа налево до тех пор, пока не будет достигнута данная цифра.

Для пересчета количество тромбоцитов 1 мкл на 1 литр крови число эритроцитов и тромбоцитов перемножают, делят на 1 тысячу.

Подробно о подсчете тромбоцитов по Фонио.

Подсчет тромбоцитов в анализаторе

Для метода подсчета количества тромбоцитов используют капиллярную или венозную кровь. Добавляет антикоагулянт, чтобы она не свернулась. Если это произойдет, потребуется повторное изъятие биологической жидкости. Жидкость подносят к полуавтоматическому анализатору, который забирает объем жидкости, равный 1 мл.

Прибор самостоятельно подсчитывает данные, выдавая их на бланке исследования. Читайте о домашних анализаторах крови.

Какой способ подсчета тромбоцитов лучше?

С помощью подсчета показателя на мазке возможно визуально определить параметры клеток. Выявляется их размер, форма, патологические образования. Врач может ошибиться при подсчете или прокрасить мазок неправильно. В первом случае возможна постановка ошибочного диагноза. Для его подтверждения потребуется повторное исследование.

Внимание! Полуавтоматический анализатор в точности подсчитывает количество клеток, редко выдает ошибочный результат по этому параметру. Но аппарат не сможет рассмотреть параметры клеток, их атипичность.

Рекомендовано сначала проводить подсчет тромбоцитов вручную, затем исследовать их на полуавтоматическом анализаторе.

Ошибки при подсчете тромбоцитов

Возможны следующие ошибки в подготовительном этапе и проведении анализа:

  • отсутствие подготовки пациента в виде диеты, ограничения физической активности и времени сдачи исследования;
  • использование первой капли крови для проведения анализа (по правилам ее стирают водой, так как в ней содержится большое число форменных элементов);
  • отсутствие добавления антикоагулянта, который препятствует образованию сгустка;
  • ошибка в покраске мазка (использование просроченных или некачественных реактивов, укороченное или чрезмерно продолжительное время воздействие краски);
  • ошибки в подсчете клеток. 

Для идентификации заболевания или его профилактики необходимо раз в год проходить обследование крови. Одним из тестирований является подсчет тромбоцитов. Для этого используют ручной подсчет или применение специализированного аппарата. Обе методики имеют плюсы и минусы, рекомендуется проводить их по очереди для подтверждения диагноза и отсутствия возможной ошибки. После получения данных обращаются к врачу. Только он сможет правильно расшифровать данные, назначив лечение при выявлении нарушений.

Екатерина Беликова, врач лабораторной диагностики, специально для Mirmam.pro

Полезное видео

mirmam.pro

Подсчет количества тромбоцитов в счетной камере Горяева

Принцип. Подсчет числа тромбоцитов в разведенной крови в счетной камере с применением фазово-контрастного устройства и расчет их количества в 1 мкл или 1 л крови.

Реактивы: 1) реактив 1: кокаина гидрохлорид — 3 г; натрия хлорид — 0,25 г; фурацилин — 0,25 г; дистиллированная вода— 100мл; 2) реактив 2: 1% раствор оксалата аммония. Раствор кипятят и фильтруют, хранят в холодильнике.

Наиболее быстрый и полный лизис эритроцитов вызывает 1% раствор оксалата аммония.

Ход определения. Для подсчета тромбоцитов предпочтительнее использовать венозную кровь. В качестве антикоагулянта рекомендуется применять ЭДТА (этилендиаминтетраацетат натрия). При взятии капиллярной крови из пальца высока вероятность агрегации тромбоцитов. Перед исследованием необходимо убедиться в отсутствии сгустков крови.

Исследуемую кровь разводят в 200 раз, для этого в сухую пробирку набирают 4 мл реактива 1 или 2 и 0,02 мл крови. Перемешивают и оставляют на 25–30 мин для гемолиза эритроцитов. Подготавливают камеру Горяева и заполняют ее предварительно перемешанной разведенной кровью (см. «Подсчет эритроцитов, лейкоцитов»). Счетную камеру помещают во влажную среду (чашка Петри с уложенной по краям смоченной водой фильтровальной бумагой) на 5 мин для оседания тромбоцитов. Используя объектив 40× с фазово-контрастным устройством, производят подсчет тромбоцитов в 25 больших квадратах счетной камеры.

Тромбоциты выглядят в счетной камере как мелкие, хорошо преломляющие свет образования.

Расчет числа тромбоцитов в 1 мкл крови проводят по формуле:

где X — число тромбоцитов в 1 мкл крови; а — число тромбоцитов, сосчитанных в 25 больших квадратах счетной камеры; 200 — разведение крови; 25 — число больших квадратов; 250–1(1/250) — объем одного большого квадрата, так как сторона квадрата равна 5–1 мм, а высота — 10–1 мм.

На практике число сосчитанных тромбоцитов умножают на 2000. При пересчете на 1 л крови умножают еще на 106.

Примечание. Вся используемая стеклянная посуда и камера Горяева должны быть тщательно вымыты, иначе грязевые и пылевые частицы, сходные по размеру с тромбоцитами, могут быть ошибочно учтены при подсчете.

См. также:

  • Подсчет тромбоцитов в мазках крови по Фонио (A. Fonio)
  • Тромбоциты

onlab.info

Метод Айви

Несколько более чувствительным является тест Айви, когда оценивают время кровотечения из надрезов на коже ладонной поверхности верхней трети предплечья на фоне искусственного повышения венозного давления с помощью манжеты для определения АД, в которой поддерживают давление 40 мм рт. ст. (рис. 1.87).

Рис. 1.87. Определение времени кровотечения по Айви. Схема

В норме время кровотечения по Айви не превышает 8 минут.

Подсчет числа тромбоцитов

Наибольшее распространение в настоящее время получили три метода подсчета тромбоцитов в крови:

1. Подсчет в камере Горяева;

2. Подсчет в мазках крови;

3. Электронно-автоматический метод.

Подсчет в камере Горяева

Метод подсчета тромбоцитов в камере Горяева является самым точным, но достаточно трудоемким.

Подсчет тромбоцитов в 1 л проводится по стандартной методике с учетом разведения крови и объема большого квадрата счетной сетки Горяева с применением фазово-контрастного микроскопа для лучшего контрастирования тромбоцитов.

Исследуемую кровь разводят в 200 раз раствором аммония оксалата или раствором, содержащим кокаина гидрохлорид, натрия хлорид, фурациллин и дистиллированную воду. Разведенную кровь перемешивают и оставляют на 30 минут для гемолиза эритроцитов.

Заполняют камеру Горяева и подсчитывают тромбоциты в 25 больших квадратах. Практически для расчета количества тромбоцитов в 1 л крови число сосчитанных в 25 больших квадратах кровяных пластинах умножают на 2х106.

Метод подсчета тромбоцитов в окрашенных мазках крови

Метод подсчета тромбоцитов в окрашенных мазках крови основан на подсчете числа тромбоцитов на 1000 эритроцитов с последующим пересчетом на 1 л крови.

Кровь смешивают с раствором магнезии сульфата или ЭДТА. Мазки готовят на предметных стеклах и окрашивают их по Романовскому-Гимзе. В каждом поле зрения микроскопа подсчитывают число эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор, пока не будут просчитаны 1000 эритроцитов.

Зная число эритроцитов в 1 л крови, рассчитывают количество тромбоцитов в этом объеме.

Автоматический метод подсчета тромбоцитов

Автоматический метод подсчета тромбоцитов с использованием современных электронных приборов значительно облегчает и ускоряет исследование, в связи, с чем находит в последние годы все большее распространение в клинической практике (рис. 1.88).

Рис. 1.88. Автоматический анализатор для определения числа тромбоцитов

У здоровых людей количество тромбоцитов в крови составляет 180-320  109/л.

Уменьшение числа тромбоцитов ниже 150  109/л носит название тромбоцитопения.

Снижение количества тромбоцитов возникает в результате:

  1. недостаточного их образования в костном мозге;

  2. повышенного потребления в сосудистой системе;

  3. повышенного разрушения.

Наиболее частыми причинами снижения количества тромбоцитов в крови представлены в приложении 1 712051106.

Ретракция сгустка крови

В клинической практике чаще используют непрямые методы оценки ретракции сгустка. Один из них заключается в определении объема сыворотки, выделяемой при ретракции сгустка крови, по отношению к объему плазмы исследуемой крови (рис. 1.89).

Рис. 1.89. Схема определения ретракции кровяного сгустка. а, б, в — последовательные этапы исследования. Объяснение в тексте

В градуированную центрифужную пробирку набирают 5 мл крови, опускают в нее деревянную палочку и помещают пробирку в водяную баню (рис. 1.89, а).

В исследуемой крови определяют показатель гематокрита. Через 1 ч после свертывания крови сгусток, прикрепившийся к палочке, удаляют, дав жидкой части стечь обратно в пробирку (рис. 1.89, б). Далее измеряют объем жидкости, оставшейся в пробирке, центрифугируют ее при 3000 об/мин в течение 5 минут и измеряют объем осевших эритроцитов (рис. 1.89, в). Искомый объем сыворотки определяют по разнице между объемом оставшейся в пробирке жидкости и объемом эритроцитов.

Ретракцию сгустка рассчитывают по формуле:

Ретракция сгустка = ОС/ОП;

где ОС — объем сыворотки после ретракции сгустка;

ОП — объем плазмы перед началом исследования.

Объем плазмы можно определить следующим образом:

ОП = ОК х (100 - Ht)/100

где ОК — объем исследуемой крови;

Ht — гематокрит.

Объем сыворотки крови после ретракции сгустка всегда меньше объема плазмы перед началом исследования, так как часть жидкой части крови остается в сгустке. Чем больше сокращается сгусток, тем больше в пробирке образуется сыворотки, и наоборот.

Запомните

В норме ретракция сгустка составляет 40—95%. Ее уменьшение наблюдается при выраженных тромбоцитопениях и тромбастении Гланцмана.

studfiles.net

Определение количества тромбоцитов в крови

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ТРОМБОЦИТОВ В КРОВИ

Микроскопический метод подсчета

Чаще всего используется метод подсчета тромбоцитов в счетной камере Горяева микроскопией при фазовом контрасте, т. е. с фазово-контрастной приставкой. Мало точен и не может быть рекомендован метод подсчета тромбоцитов в мазке крови.

В настоящее время все шире используются определение количества тромбоцитов и их распределение по величине (гистограмма) с помощью автоматических счетчиков крови. Эти аппараты точны и позволяют проводить экспресс-диагностику (определения выполняются за 1 мин).

Принцип. Производится подсчет тромбоцитов в камере Горяева с применением в качестве разводящей и гемолизирующей жидкости раствора оксалата аммония. При подсчете используют фазово-контрастную микроскопию.

Реактивы. 1% раствор оксалата аммония.

Ход определения. Исследование можно проводить как в крови, полученной из пальца, так и в стабилизированной цитратом венозной крови. В последнем случае полученный при подсчете результат умножают на коэффициент 1,1 (учитывают разведение венозной крови раствором цитрата натрия - 9:1).

Разведение крови. Самым удобным и достаточно точным является способ разведения крови в пробирках (не в меланжере). Для этого, в предварительно высушенную чистую силиконированную или пластиковую (полистирол) пробирку пипеткой отмеривают 1,98 мл 1% оксалата аммония и осторожно вносят в нее 0,02 мл крови. В течение 1-2 мин содержимое пробирки тщательно перемешивают без вспенивания. Заполняют две камеры Горяева и на 10-15 мин помещают их для оседания тромбоцитов во влажную камеру (чашку Петри со смоченной фильтровальной бумагой или марлей). В каждой камере подсчитывают тромбоциты в 25 больших квадратах.

Фазово-контрастная микроскопия проводится при помощи обычного микроскопа, осветителя типа ОИ-19 (или аналогичного) и устройства для наблюдения методом фазового контраста КФ-1 или КФ-4.

Подготовка микроскопа. После установки на микроскопе фазовых объективов и фазового конденсора производят фокусировку объективов 40х на сетке камеры Горяева. Устанавливают освещение и центрируют изображение фазовой пластинки и кольцевой диафрагмы. Микроскопию проводят с зеленым светофильтром. При работе с фазово-контрастной установкой необходимо пользоваться камерами одного типа, так как фокусировка оптических систем зависит от толщины стекла камеры.

Расчет определения числа тромбоцитов в 1 мкл крови. Среднюю арифметическую величину из двух параллельных определений умножают на 1000 (площадь 25 больших квадратов - 1 мм2, высота камеры - 0,1 мм, разведение 1:100; следовательно, количество тромбоцитов должно быть умножено на1 х10х100 = 1000).

Нормальные пределы колебаний числа тромбоцитов в крови у человека составляют от 170 до 350 х 109/л. Ошибка метода ± 6,5%.

Подсчет тромбоцитов в крови и определение их размера в мазке - важная часть диагностики тромбоцитопений, эссенциальной и полицитемической тромбоцитемии, ДВС-синдрома, тромботической тромбоцитопенической пурпуры и других микротромбоваскулитов, нарушений гемостаза при аутоимунных формах патологии (СКВ, антифосфолипидном синдроме и др.) и при гепатолиенальном синдроме. При наследственных тромбоцитопатиях наблюдаются формы с микроцитозом (синдром Вискотта-Олдрича) и преобладанием гигантских форм кровяных пластинок (аномалии Бернара-Сулье и Мей-Хегглина), а также формы без изменения размеров этих клеточных элементов.

Подсчет тромбоцитов на гематологическом анализаторе.

На сегодняшний день методом выбора при исследовании тромбоцитов является их определение на автоматическом анализаторе. Автоматические счетчики позволяют получать достаточно надежные результаты при определении количества тромбоцитов.

При подсчете тромбоцитов по Фонио коэффициент вариации находится в пределах 20%, в камере Горяева - составляет 7-10%, тогда как автоматический подсчет воспроизводится с точностью до 2-4%.

Современные анализаторы сигнализируют о выходе количества тромбоцитов за референтные пределы, наличии агрегатов тромбоцитов, макротромбоцитов или других элементов, сравнимых по объему с тромбоцитами (микроэритроциты), что существенно облегчает трактовку получаемых результатов.

В то же время следует иметь в виду, что в отличие от ручного подсчета тромбоцитов, где проводится предварительный лизис эритроцитов, автоматические счетчики крови анализируют тромбоциты и эритроциты в одной камере без предварительной обработки. Тромбоциты распознаются по размерам в диапазоне 2-20 фл. Это создает проблему дифференцирования больших форм тромбоцитов (макротромбоцитов) и сравнимых с ними по объему эритроцитов (микроцитов), их фрагментов (шизоцитов), а также отшнуровавшихся фрагментов цитоплазмы лейкоцитов (клеточный дебрис).

Ложное занижение числа тромбоцитов может быть при их агрегации, агглютинации под действием тромбоцитарных агглютининов и при прилипании тромбоцитов к лейкоцитам (тромбоцитарный «сателлитизм»). При подсчете на гематологических анализаторах в качестве антикоагулянта используется ЭДТА. При наличии аутоантител к тромбоцитам калиевая соль ЭДТА инициирует агрегацию тромбоцитов, что проявляется псевдотромбоцитопенией.

Нормальные величины. Количество тромбоцитов у здоровых людей составляет х 109/л.

Клиническое значение

Снижение количества PLT в крови - тромбоцитопения - может развиваться в результате снижения продукции PLT:

·  наследственные: синдром Франкони (Фанкони), врожденная тромбоцитопения, краснуха новорожденных;

·  приобретенные: лейкозы, миелодиспластические синдромы, миелофиброз, метастазы новообразований в костный мозг; дефицит витамина В12 и фолиевои кислоты (мегалобластные анемии), ночная пароксизмальная гемоглобинурия, вирусные инфекции, интоксикации, наследственные аномалии, ионизирующее облучение, прием миелодепрессивных препаратов, циклическая тромбоцитопения, почечная недостаточность. в результате повышения деструкции PUT: инфекции (значительное, иногда катастрофическое снижение PLT, наблюдается при Конго-Крымской геморрагической лихорадке), эклампсия беременных, гемолитико-уремический синдром (ГУС), ВИЧ-инфекция, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, системная красная волчанка, хронический лимфолейкоз, хронический активный гепатит, посттрансфузионная тромбоцитопения; гемодиализ, кровотечения, разрушение в селезенке (гиперспленизм при болезнях накопления, лимфомах, волосатоклеточном лейкозе, миелопролиферативных заболеваниях, портальной гипертензии);

·  в результате потребления PLT: синдром ДВС.

Клинико-диагностическое значение тромбоцитопений (по и соавт., 2002)

Патогенетические механизмы

Клинические ситуациии патологические состояния

Недостаточность гемопоэза - нарушение образования тромбоцитов

Гипо-и апластические состояния, лейкозы, метастазы рака в костный мозг, ионизирующее облучение, химиотерапия, дефицит витамина В12 или фолиевои кислоты, вирусные инфекции, сепсис, милиарный туберкулез и др.

Повышенное потребление тромбоцитов

Кровопотеря, ДВС, гигантская гемангиома, тромбоз, геморрагическая тромбоцитемия.

Повышенная деструкция тромбоцитов (внутриклеточный, внутрисосудистый гемолиз)

Ауто - и иммунные гемолитические анемии, изоиммунные, гетероиммунные (гаптеновые), лекарственные, вирусные, системная красная волчанка, лимфопролиферативные заболевания, поеттрансфузионные реакции и др.

Механические повреждения тромбоцитов

Протезирование клапанов сердца, экстракорпоральное кровообращение.

Интоксикация: экзогенная, эндогенная

Химические вещества, лекарственные препараты, алкоголь, уремия, тяжелые заболевания печени.

Повышенная секвестрация в селезенке (гиперспленизм)

Спленомегалия при циррозе печени, портальной гипертензии, гистиоцитозах, болезнях накопления, болезни Гоше, синдроме Фелти, туберкулезе селезенки, миелопролиферативных заболеваниях, талассемии.

Иммунные тромбоцитопении

(по и соавт., 2002)

Заболевание

Характеристика антитромбоцитарных антител

Идиопатическая (аутоиммунная) тромбоцитарная пурпура

Аутоантитела против неизмененных антигенов тромбоцитов больного

Гаптеновая (гетероимунная) тромбоцитопения

Гаптеновые аутоантитела против измененных или чужеродных антигенов на поверхности тромбоцитов

Лекарственная тромбоцитопения

Антитела против комплекса лекарства (хинин, гепарин) с тромбоцитарным антигеном

Тромбоцитопения, ассоциированная с вирусной инфекцией

Антитела против вирусных антигенов, фиксированных на поверхности тромбоцитов, или против измененных тромбоцитарных антигенов

Аллоиммунная тромбоцитопения

Аллоантитела против аллоантигенов тромбоцитов плода или переливаемых тромбоцитов

Неонатальная аллоиммунная тромбоцитопеническая пурпура

Аллоантитела матери, проникшие в организм плода. Направлены против аллоантигенов тромбоцитов плода и отца, отсутствующих на тромбоцитах матери

Повышение количества PLT в крови - тромбоцитоз - характерно для миелопролиферативных заболеваний. Тромбоцитоз наблюдается также при злокачественных новообразованиях, после операций, при воспалительных заболеваниях (острый ревматизм, ревматоидный артрит, туберкулез, остеомиелит), после спленэктомии, циррозе печени, кровотечениях, в период выздоровления при мегалобластных анемиях, лечении кортикостероидами, остром гемолизе, физических перенапряжениях.

Тромбоцитозы

Тромбоцитоз

Заболевания и синдромы

Реактивный

Спленэктомия, острая кровопотеря, острый гемолиз, состояние после операции, злокачественные новообразования, ревматоидный артрит, туберкулез, язвенный колит, остеомиелит

Опухолевый

Миелопролиферативные заболевания (хронический миелолейкоз, идиопатический миелофиброз, эритремия, хронический мегакариоцитарный лейкоз), острый мегакариобластный лейкоз, идиопатическая геморрагическая тромбоцитемия

Средний объем тромбоцита (МРV)

У здоровых людей MPV равен 6-12 фл и находится в обратной зависимости от числа тромбоцитов. MPV увеличивается с возрастом. У мужчин MPV несколько выше, чем у женщин.

Использование ЭДТА в качестве антикоагулянта вызывает изменение формы тромбоцитов от диска к сфере, что приводит к увеличению MPV на 10-12% в течение 2 часов, а затем показатель существенно не меняется. Под действием цитрата натрия MPV может уменьшаться или увеличиваться, а при высокой концентрации (1:4) - не изменяется со временем. Кроме типа применяемого антикоагулянта и времени от момента взятия пробы до исследования, на MPV оказывает влияние температура окружающей среды. Преходящее увеличение MPV отмечается у рабочих, контактирующих с асфальтовыми испарениями, органическими растворителями. MPV - важный диагностический показатель функции тромбоцитов.

PDW - показатель, являющийся мерой гетерогенности размеров (анизоцитоза) тромбоцитов. Величина PDW в среднем составляет 10-15%.

Как артефакт, ложно завышенное увеличение PDW может быть связано с присутствием микроцитов, шизоцитов, микроагрегатов тромбоцитов, фрагментов цитоплазмы лейкоцитов.

Этот показатель находится в обратной зависимости от числа тромбоцитов и их периода жизни. В каждом конкретном случае важна не только величина PDW, но и ее динамика во времени, а также связь с другими тромбоцитарными показателями. Так, увеличение PDW с одновременным снижением MPV свидетельствует о преобладании микротромбоцитов среди общей популяции тромбоцитов (указывает на угнетение тромбоцитопоэза), а сочетание повышенного PDW с увеличением MPV отражает нарастание числа макротромбоцитов (усиление продукции тромбоцитов). Одновременное присутствие фракций макротромбоцитов и микротромбоцитов ведет к увеличению PDW, но MPV может оставаться в пределах нормы. В современных гематологических анализаторах отдельными показателями указывается процентное содержание микротромбоцитов (MicroPLT) и макротромбоцитов (MacroPLT).

PDW может применяться для дифференциальной диагностики. Так, увеличение PDW свыше 15% было обнаружено у 50% больных эссенциальной тромбоцитемией, у 21% пациентов с реактивным тромбоцитозом и лишь у 14% здоровых людей.

РСТ - показатель, характеризующий процент тромбоцитарной массы в объеме крови: вычисляется суммированием прямо измеренных объемов тромбоцитов или произведением среднего объема тромбоцитов на их число.

У здорового человека показатель стремится остаться стабильным: при уменьшении числа тромбоцитов усиливается тромбопоэз, в циркулирующую кровь выбрасывается большее число молодых макротромбоцитов, что ведет к увеличению MPV. При увеличении количества циркулирующих тромбоцитов снижается продукция их в костном мозге, тем самым уменьшается процент макротромбоцитов и MPV уменьшается. Однако при нарушении этого равновесия происходит или уменьшение РСТ, что, в конечном счете, приводит к патологии первичного гемостаза и риску возникновения кровотечений, или повышение РСТ, увеличивающее активность тромбоцитов и их способность к агрегации. Это повышает риск тромбозов.

Нормальные значения РСТ варьируют в пределах 0,15-0,35%. Было обнаружено, что снижение РСТ менее 0,1% обусловило возникновение послеоперационных кровотечений у пациентов с развившейся тромбоцитопенией. Также было отмечено, что этот показатель оказался более чувствительным для оценки риска возникновения кровотечения, чем число тромбоцитов.

Если скрининговые методы указывают на нарушение функции тромбоцитов, необходимо выполнить специальные тесты с учетом диеты и лекарственных препаратов, принимаемых пациентом (отмена за 7-10 суток перед исследованием глюкокортикостероидов, аспирина и других нестероидных противовоспалительных средств, адреноблокаторов, блокаторов кальциевых каналов, антиагрегантов: пентоксифиллина, папаверина, теофиллина, дипиридамола, тиклопидина, антибиотиков - пенициллина, карбенициллина).

Методы определения длительности кровотечения

Длительность кровотечения является скрининговым тестом для выявления нарушений первичного гемостаза. Метод основан на определении времени кровотечения из нанесенной на поверхности кожных покровов небольшой ранки стандартного размера. Это время зависит от способности сосудисто-тромбоцитарных гемостатических механизмов останавливать кровотечение из поврежденных мелких сосудов и капиллляров и поэтому его продолжительность может характеризовать состояние первичного гемостаза. Оно может быть нарушено вследствие дефектов сосудистого звена, неполноценности функциональных свойств кровяных пластинок или дефицита/дефекта плазменных кофакторов тромбоцитарных реакций (фибриногена, фактора Виллебранда), выраженной тромбоцитопении. При снижении числа тромбоцитов менее 100x109/л имеется прямая связь между степенью тромбоцитопении и удлинением времени кровотечения. Длительность кровотечения коррелирует также с геморрагическими тенденциями при тромбоцитопатиях и болезни Виллебранда. Увеличение времени кровотечения наблюдается и при тяжелой анемии (Ht

pandia.ru

Тромбоциты

кровь птица лейкоцит эритроцит

Функции тромбоцитов:

Участвуют в процессе свертывания крови, выделяя тромбоцитарные факторы.

Служат строительным материалом для первичного тромба.

Выделяют ретрактозимы, которые необходимы для уплотнения кровяного сгустка.

Выделяют тромбоцитарный фактор роста, который стимулирует деление клеток.

Укрепляют стенки кровеносных сосудов.

Переносят различные вещества (серотонин, АТФ, ферменты, гормоны и др.).

Обладают способностью к фагоцитозу.

Тромбоциты кур обычно немного меньше эритроцитов. Размеры их варьируют от 5,5 х 5,5 до 4,6 х 12,9 мкм. В отличии от эритроцитов форма клеток напоминает неправильный эллипс с небольшими выпячиваниями протоплазмы. Протоплазма окрашивается в нежный серовато-голубой цвет. В ней встречаются отдельно лежащие гранулы. Ядро тромбоцита может быть круглым, но чаще оно имеет форму неправильного овала. Располагается в центре клетки или несколько эксцентрично, окрашивается в розовато-фиолетовый цвет (рис. 3). Количество тромбоцитов у кур достигает 30-100 х 109/л.

Подсчет количества тромбоцитов в камере Горяева

Цель опыта. Отработать технику подсчета тромбоцитов.

Для работы необходимо: курица или ее кровь, микроскопы, счетные камеры Горяева, покровные стекла, разбавитель (краска Романовского-Гимзы 10 мл, нейтральный формалин 5 мл, 0,85 % р-р хлорида натрия 85 мл), пробирки, пипетки на 5 мл и на 0,02 мл, 70 % этиловый спирт, вата.

Ход работы: Количество тромбоцитов подсчитывают в камере Горяева. Для этого пипеткой отмеряют в пробирку 4,0 мл разбавителя. В капилляр от гемометра Сали набирают кровь до отметки (0,02 мл), обтерев кончик капилляра ваткой и, опустив его в разбавитель, кровь медленно выдувают и этим же раствором дважды промывают капилляр. Пробирку закрывают резиновой пробкой, и содержимое тщательно перемешивают. В капилляр Сали набирают содержимое пробирки и заряжают камеру. Подсчет тромбоцитов производится при увеличении в 280 раз во всех больших разграфленных на 16 маленьких квадратах. Тромбоциты встречаются в виде скоплений по 5-10 клеток.

Подсчет количества тромбоцитов в 1 мкл крови ведут по формуле:

Х=Ах4000х200, где

400

А- количество тромбоцитов, сосчитанных в 400 маленьких квадратах;

  • 1/4000мм3 - объем одного маленького квадрата;
  • 200- разведение крови;
  • 400- количество маленьких квадратиков.

Можно воспользоваться более простой формулой -

Х = А х 2000

Записать результаты подсчета.

Цель опыта. Знакомство с техникой приготовления мазков крови.

Для работы необходимо: кровь курицы, обезжиренные предметные и шлифовальные стекла, краска Лейшмана, 70 % этиловый спирт, вата, пинцет, пипетка на 10 мл, глазные пипетки, ванночки почкообразные, карандаш.

Ход работы. Мазки крови можно получить на чистых обезжиренных предметных стеклах. Для этого их моют в мыльной воде или с содой, складывают в стеклянные банки и заливают на 2-3 дня концентрированной серной кислотой (обезжиривают). Потом моют в водопроводной воде, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают и помещают в банку, в которой находится смесь эфира и спирта (1:1).

В этом растворе приготовленные стекла могут храниться длительное время.

Перед использованием стекла извлекают из банки пинцетом, высушивают на воздухе или протирают чистым полотенцем.

Мазки легче готовить из свежей крови, но можно использовать стабилизированную кровь (кровь предохраненную от свертывания).

Предметное стекло обычно фиксируют в левой руке между большим и указательным пальцами, или кладут на ровную поверхность и наносят небольшую каплю крови глазной пипеткой на край стекла. Берут шлифовальное стекло и устанавливают его под углом 35-450 по отношению к предметному и осторожно подводят к капле крови. Когда капля крови равномерно распределится около нижнего ребра шлифовального стекла, его плавно и относительно быстро передвигают справа налево по предметному стеклу (рис. 2).

Хорошо приготовленный мазок должен быть ровным и тонким.

Мазок высушивают на воздухе (можно на подогретых предметах). На высушенном мазке (в его начале) пишут номер птицы и дату. Наиболее распространенным методом окраски мазков крови птицы является окраска по Лейшману. При этом нет необходимости фиксировать мазки. В100 г химически чистого метилового спирта растворяют 0,5 - 1,0 г краски Лейшмана и склянку с ней ставят на сутки в термостат при Т 37оС. Через 24 часа краску охлаждают при комнатной температуре и осторожно сливают с осадка (фильтровать нельзя). Хранят краску в склянке из темного стекла. При окрашивании мазков крови краску наносят на нефиксированный мазок и распределяют по всей поверхности. Через 1-2 минуты к краске добавляют равное количество капель воды и докрашивают еще 2-7 минуты. Не сливая краски, мазок обильно промывают водой и высушивают.

Мазки крови птиц можно окрашивать так же по Май-Грюнвальду, по Романовскому и по Папенгейму.


Смотрите также